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全球首篇|Visium空间转录组技术如何应用于人类背外侧前额叶皮层研究
发布时间: 2020-04-16 发布人:生物在线 打印 关闭

近两年,空间转录组技术大火,对新技术感兴趣的小伙伴可能都已经看过几篇空间转录组的文章了,但大家是否发现之前空间转录组文章中实验所用的芯片规格和现在10x Genomics公司推出的Visium空间基因表达芯片规格是不同的呢?因为这些文章都是利用原Spatial Transcriptomics公司的技术,它在2018年底已被10x Genomics公司所收购。10x Genomics Visium空间基因表达解决方案是第一代“Spatial Transcriptomics”方法的升级版,空间分辨率是原来的5倍,具有更高的性价比。3月份,全球第一篇Visium预发表文章作者在10x官方网络研讨会上分享了空间转录组技术如何助力人类背外侧前额叶皮层研究(详情点击下方阅读原文),下面,就和勤勉的小编一起学习这篇文章吧~

研究背景

大脑的功能与空间结构密切相关,这种结构-功能关系在人大脑皮层的层状组织中尤为明显,其中位于不同皮层的细胞表现出不同的基因表达模式,以及不同的形态、生理和连接模式。由于与神经精神疾病相关的基因表达于特定的大脑皮层,因此,在细胞分辨率下定位人大脑中空间基因的表达对于进一步了解疾病致病机制至关重要。

本研究选择人背外侧前额叶皮层(DLPFC,一种与许多神经精神疾病有关的大脑区域)进行10x Genomics Visium空间转录组测序,绘制DLPFC基因表达的层状图谱,并利用已发表的大规模snRNA-seq研究的数据进行验证,同时提高细胞亚群注释的准确性。为了进一步临床转化应用,将本研究数据集与已发表的各种神经精神疾病基因集进行了整合,以证实自闭症谱系障碍(ASD)风险基因的优先layer-enriched表达和几种神经精神病的风险layer-enriched关联,说明了本实验数据可应用于临床转化。


实验材料


人死后的背外侧前额叶皮质(DLPFC)组织切片,12张,组织切片厚度为10 μm。


文章思路


图1 文章研究概览

主要研究结果

1. Visium空间转录组数据统计

选取3个正常成人,分别获取0 μm处和300 μm处的2对连续的组织切片,每对连续的组织切片可作为空间重复,共12个样本,平均每张切片测序量为291.1M reads,每个spot平均检测到1,734个基因和3,462个唯一的UMI。平均每个spot包含3.3个细胞。在垂直于脑膜表面的平面中获取组织切片,该平面延伸至灰质和白质交界处。通过勾画第6层(L6)和相邻的白质(WM)之间的边界和通过每个组织切片的灰质/神经元,WM /少突胶质细胞和L5的标记基因(SNAP25、MOBP和PCP4)识别L5来确认每个样品的方向。

图2 空间转录组实验设计


2. DLPFC的基因表达

通过对每个空间重复中每一层每个基因的总UMI数生成layer-enriched表达谱来进行 pseudo-bulked处理,将12个样本中的47,681个点汇总到76个分层聚合的基因图谱中, 消除了稀疏性并大幅增加了基因的UMI覆盖率。layer-enriched表达谱的无监督聚类揭示了与皮层差异(尤其是白质和灰质之间)相关的数据变化的主要成分,其在每对空间重复样本中一致性较高。利用3种Layer-level基因建模策略(ANOVA、Enrichment和Pairwise)进行差异基因分析,均显示人的成年DLPFC不同层之间广泛的基因表达差异。

图3 DLPFC中Layer-enriched 基因表达


3. 鉴定人类皮层中新的layer-enriched基因

本研究系统的评估了已发表的人和啮齿动物大脑皮层相关数据集中的marker基因在成人DLPFC 的layer-enriched基因表达数据集中的鲁棒性,进一步证实了与分层富集相关的典型marker基因,同时利用艾伦大脑研究所的人类大脑图谱中公开发表的smFISH数据进行验证。本研究中还找到了新的layer-enriched差异表达基因,并利用RNA scope进行验证。

图4 已发表的smFISH数据验证Visium数据集有效性


4. 单细胞核转录组测序(snRNA-seq)的空间注册

将人脑组织生成的snRNA-seq数据集增加空间分辨率,有可能为分子定义的细胞类型的功能提供更深入的了解。从Visium数据中enrichment model下获得的layer-enriched表达谱和差异表达统计相关数据被用于snRNA-seq数据集进行空间“注册”,可向不包含固有解剖信息的数据驱动的表达cluster中添加layer-enriched信息。首先使用来自已发表的snRNA-seq数据和bulk RNA-seq数据来验证这种策略。然后使用layer-enriched的统计数据对来自人类皮层的三个独立snRNA-seq数据集进行空间“注册”,分别为本实验的2个DLPFC样本的snRNA-seq数据、已发表的48个阿尔茨海默病样本的snRNA-seq数据和41个样本的自闭症谱系障碍的snRNA-seq数据,空间配准策略可应用于任何现有的来自分离细胞的snRNA-seq或scRNA-seq数据集,以补充解剖学信息。

图5 snRNA-seq数据空间注册


5. layer-enriched基因表达谱的临床意义

分别选取与不同紊乱疾病相关的基因集、各种脑疾病患者和正常人的死后大脑中差异表达的基因集和全转录组关联研究(TWAS)的遗传风险相关的基因集来评估空间基因表达的临床相关性,证明了ASD和SCZD中涉及的基因的优先layer-enriched表达,分析结果显示可通过将成年DLPFC的layer-enriched基因表达纳入风险基因的解释,以便收集临床见解。例如,ASD和SCZD中涉及的基因的优先layer-enriched表达,主要与神经发育迟缓(NDD)相关的基因在L2中优先表达,而主要与ASD相关的基因在L5中优先表达。

图6 Layer-enrichment神经发育和神经精神的基因集

6. DLPFC中的数据驱动的layer-enriched分群


相对于基于细胞结构的人工注释laminar cluster,本研究评估了基于空间可变基因的数据驱动的注释方法。无监督的方法可以用来识别新的空间组织,特别是与抑制神经元亚群、脑血管或免疫功能相关的空间组织,同时还确定了NPY、HBB和IGKC的可变空间表达。layer-enriched基因可以用来帮助数据驱动的人类皮层聚类,并且比以前定义的标记表现得更好。数据驱动的方法可以识别之前未知的细胞组织,也可以应用于其他形态模式不像大脑皮层那样明确的人类组织或大脑结构。

图7 DLPFC中的数据驱动的layer-enriched分群


小结

本研究绘制了人DLPFC的基因表达空间层状图谱,发现成年人DLPFC不同层之间广泛的基因表达差异。利用已发表的大规模snRNA-seq研究的数据进行验证,找到新的 layer-enriched 差异表达基因,以便提高细胞亚群注释的准确性,同时空间“注册”策略可对常规的snRNA-seq或scRNA-seq数据集进行解剖学信息的补充。通过将成年DLPFC的layer-enriched基因表达纳入风险基因的解释,以便收集临床见解。数据驱动的方法可以识别之前未知的细胞组织,也可以应用于其他形态模式不像大脑皮层那样明确的人类组织或大脑结构。鉴于空间转录组学有望将分子细胞类型与形态学、生理学和连接性相关的功能学联系起来,这将成为神经科学和精神病学中转录组学的下一个前沿。

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参考文献:

Kristen R. Maynard, Leonardo Collado-Torres, Lukas M. Weber,et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex[J]. bioRxiv, 2020.



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